随着人们对饮食健康的关注与日俱增,功能性食品和营养品的开发成为一个热门话题。多酚种类多样,在植物基原料中广泛存在,植物基原料多酚已成为功能性食品和营养品中的重要成分之一。已有学者证明植物基原料多酚对人类健康有多种保健功效,如抗氧化、抑菌、抗癌等。目前,对植物基原料多酚的研究主要集中于游离多酚的生物活性、提取工艺和工业规模的产品开发方面,这主要是因为游离多酚是多酚的主要类型,其主要分布于植物细胞液泡,易萃取。现今,游离多酚的提取方法有很多种,如溶剂萃取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法及多种方法联用的提取模式已在食品、化工、医药、材料等多个领域得到应用。然而,从复杂的植物基原料中提取出游离多酚的效率受不同提取工艺影响。提取工艺不仅影响投入成本、最终生产率和产品纯度,还影响游离多酚提取物的生物活性。因此,需要一种经济有效且环境友好的方法来分离游离多酚。分离纯化过程是游离多酚产品开发的另一个重要步骤。目前,植物基原料游离多酚的分离纯化方法主要包括了金属离子沉淀法、凝胶柱层析法、吸附树脂法、膜分离技术和高速逆流色谱法等,各方法均存在其优缺点。

不同植物基原料游离多酚的种类和含量的不同,同一提取与分离纯化方法得到的最终产品得率也会不同。针对某一类植物基原料的特点选取合适的提取与分离纯化方法,仍是植物游离多酚深度加工与功能性拓展应用的挑战与难点。本文重点阐述了植物游离多酚的存在形式,在现有研究的基础上归纳游离多酚提取和分离纯化方法特点,并对植物基原料游离多酚的研究方向进行了总结和展望,为植物基原料游离多酚的提取及活性物质的开发和高值化利用提供参考。

1、游离多酚的存在形式

游离多酚是以游离态形式分布在植物体内的,多与膳食纤维以氢键、疏水相互作用、离子键、范德华力和静电相互作用等非共价键缔合。其中,氢键被认为是最普遍的结合方式之一,通常表现出较强的结合能力,例如,咖啡酸羧基上氧原子可以与纤维素上羟基的氢原子结合,从而形成广泛的氢键,使咖啡酸吸附在纤维素上(图1)。原花青素由于具有较多的酚羟基表现出明显的疏水特性,能与纤维素发生疏水相互作用(图2)。没食子酸、阿魏酸、绿原酸、儿茶素等由于在不同pH情况下会发生电离现象,容易脱离出氢质子,形成离子形式,从而与纤维素形成了离子键(图3)。目前,膳食纤维已被用作微生物触发的多酚释放系统,通过与多酚缔合,以保护上消化道中的多酚,并将其递送至结肠以发挥相关生物活性。

2、植物游离多酚的提取方法

2.1 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法是目前最广泛使用的提取植物可萃取型多酚的方法之一。常用的有机溶剂包括醇类、酯类、醚类等具有强植物细胞透过性、易回收利用、成本低、毒性小等优点,而且醇溶剂提取法的提取率高、提取设备简单,此方法更易于实现工业化生产。

 咖啡酸与纤维素之间存在的氢键作用力

原花青素与纤维素之间的疏水相互作用

不同的植物基原料组成不同,不同的酚类物质也有不同的溶解特性。因此,溶剂的选择是特定植物基原料游离多酚提取的关键。在常见的有机溶剂中(石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、异戊醇和正丁烷),正丁醇对金柑多酚提取物萃取得到的总酚含量最高,同样对于金柑多酚中总酚和总黄酮的萃取含量接近石油醚萃取效果的10倍左右。游离多酚大多储存于植物细胞液泡中,主要通过有机溶剂提取,值得注意的是,OSE法的萃取效率受所用溶剂类型和极性、游离多酚性质及植物基原料本身的影响。溶剂的选择对特定植物基原料提取效果具有显著影响,在应用OSE法提取目的成分的同时也会提取出大量杂质,同时在溶剂沸点下进行长时间提取也会导致提取物发生热降。另外,OSE法还易受到溶剂pH、提取温度、提取次数和样品颗粒大小等多种因素的影响。因此,通过尝试和改进单纯溶剂提取的同时,辅助提取法逐渐取代传统提取工艺,在缩短处理时间、减少能耗及提高产率等方面都表现出明显优势。

 纤维素与各种酚类化合物之间的离子键

2.2 超声波辅助提取法

超声波是指频率为20～50 k Hz左右的电磁波,利用机械效应使蛋白质变性,细胞组织变形。由于超声波引起的溶剂分子与植物细胞组织间加速度不同,产生的摩擦足以使纤维素或木质素等分子长链解聚,碳碳单键断开,从而使目的成分溶解于溶剂之中。超声波辅助提取法主要利用空化效应,导致介质内部气泡的形成、增大和湮灭,其产生的极大冲击波和剪切力使细胞破碎,从而增加溶质的穿透力。UAE法通过热效应增大原料中目的成分的浸提率和溶解速度,与传统方法相比,大大缩短了浸提时间,同时显著提高提取效率。然而,也有学者发现在一定范围内,游离多酚的提取量随超声时间的延长和超声波功率的增大而增多,但超声时间过长或超声功率过大,游离多酚的提取量均有所下降。这是由于游离多酚类物质不稳定,易氧化,且长时间的超声或过高能量会使游离多酚结构异构化或降解。

超声波仪器

由此可知,更优的UAE法需要将超声时间和超声波功率控制在一定范围内,否则将导致游离多酚结构遭到破坏。相较于传统提取工艺,UAE法是一种非热加工技术,较易于与其他提取方法结合使用,具有高效率与灵活性,无需对现有工艺进行重大修改即可提高萃取效率或产率。值得注意的是,UAE的萃取效率还受不同变量的影响,如超声时间、超声波振幅、液料比等,这些变量必须针对特定的植物基原料进行优化,以便产生更高的萃取率和最小的降解。此外,UAE的另一优势在于温和的体系温度,能够有效减少游离多酚的降解。

2.3 微波辅助提取法

微波辅助提取法主要是利用微波的热效应,极性物质吸收微波能会迅速产生大量热能,细胞内部温度迅速升高,最终高压导致细胞破裂,从而使溶剂进入细胞内部,缩短提取时间。与常规的加热相比,微波只加热了样品而不加热设备,提高加热效率,使提取时间大幅缩短,在结合其他提取工艺时,可表现出理想的效果。应注意的是,在选择MAE溶剂时,应考虑其微波吸收特性。由于具有高介电常数的溶剂吸收更多的微波能量,因此,溶剂极性在MAE中非常重要。通常添加一定比例的水作为极性调节剂,以调节萃取选择性和与微波相互作用的能力,达到最佳萃取效果。

同样是作为“绿色”技术,与超声波辅助法相比,MAE法的效率更高。研究表明,超声波辅助提取石榴皮中的酚类物质所需的提取时间为10 min,MAE法的提取时间仅需4 min,提取效率提高了1.7倍。ROSTAGNO等分别采用MAE法和UAE法提取大豆异黄酮,发现两种提取方法得到的产率没有显著差异,但使用MAE法可以同时处理10个样品并且得到与UAE法相同的产率。与其他传统方法相比,MAE具有提取时间短、温度可控、溶剂用量少、提取效率高、产品质量好(抗氧化活性高)及成本低等优点。因此,微波处理经济可行性可能更高,更适用于工业化生产,但需要谨慎选择加热温度和处理时间。

2.4 超临界流体萃取法

超临界流体是介于液体与气体之间的单一相态,是一种具有接近液体密度的气体,其具有较强溶解能力和较好渗透性。超临界流体萃取法是一种环境友好的技术,与传统的萃取技术相比具有许多优势。CO₂是最常用的超临界流体,它无毒、无色无味,并能在较低温度和压力下提取游离多酚。CO₂的极性较低,可以使用其他溶剂(如甲醇、乙醇)作为共溶剂,提高提取效率,但是不太适合提取高极性化合物。

超临界萃取示意图

同时,由于超临界萃取方法对于设备具有较高的要求,并且缺少成熟的连续萃取技术,限制了其在大规模工业化上的推广和应用。在使用SFE法提取游离多酚时,操作参数(温度、压力、水分含量、萃取时间、CO₂流速和液料比)是提取成功的关键,不同的SFE参数及不同的研究对象势必会产生不一样的提取效果。与传统方法相比,SFE可大大缩短萃取时间,温度和压力可控,溶剂用量少,绿色环保。尽管如此,基于相似相溶原理,SFE对于某些极性较高的酚类化合物,萃取效果并不令人满意,所用共溶剂含量不足以使游离多酚完全分离,特别是在羟基苯甲酸、羟基苯乙酸等极性酚酸的情况下。

3.植物基原料游离多酚的分离纯化

3.1 金属离子沉淀法

金属离子沉淀利用多酚类化合物能与某些金属离子(如Al³⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺等)络合成结晶性沉淀物质的特性,使多酚化合物在粗提取液中与其他物质分离开来,经过后续的过滤、洗涤等工艺处理,从而获得较高纯度的多酚。李媛等研究发现,采用离子沉淀法纯化茯砖茶茶多酚粗提液,得率可达89.99%。金属离子沉淀法具有沉淀选择性较高、工艺设备简单、原材料廉价、产品纯度高等优点,但是也存在易氧化、易参杂毒性金属离子、存在废液废渣等缺陷。近年来,在金属离子沉淀法基础上发展出了固相络合反应法,将原料与某些盐类混合,通过机械外力作用使植物基原料与盐形成络合物,然后于溶剂中分离络合物与其他物质,再通过酸溶液转溶出游离多酚。有研究采用固相络合反应法提取茶叶游离多酚,综合提取率达15.4～15.8%。该方法可以实现常温提取游离多酚,有效避免了茶多酚因热而氧化降解,是一种绿色分离纯化工艺。

3.2 凝胶柱层析法

凝胶柱层析分离原理是基于物质分子量大小差异,多酚在通过凝胶柱过程中受到阻力不同从而产生流速差(图4A),最终达到分离的目的。凝胶柱层析法具有分离效果好、产品纯度高、总得率高等优点,是植物多酚物质分离纯化的重要方法之一。目前,凝胶柱层析法应用较广的是葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。

层析示意图

有研究报道,使用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱成功分离出莲子外壳中的3个游离多酚组分,也有学者表明使用该方法能够高效提纯茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯,最终纯度可达到90%以上。这也进一步说明凝胶柱层析法具有较大的可行性及可以得到较优的产品纯度。尽管柱层析法在游离多酚的分离和纯化工艺方面已经得到广泛应用,但该方法还存在柱效、场地以及填充料老化等技术难题,简化工艺流程,提高纯化效率仍是未来重点研究的方向。

3.3 吸附树脂法

吸附树脂法(图4B)是指使用活性炭、聚酰胺、硅胶或大孔树脂等固形物作吸附剂,用适当溶剂进行洗脱,以达到分离混合物的一种方法。目前应用最广泛的是大孔树脂吸附分离法,大孔树脂是一类不含离子交换型的聚合物,具有大孔结构,能从粗提取液中有选择地吸附其中的目的成分,并通过洗脱分离而得到纯度高的产品。此法工艺操作简便、能耗较低、安全无毒、产品纯度较高、有利于大规模工业化生产。据陈明威等报道,D101型、AB-8型、HZ-841型、NKA-9型、ADS-7型等5种大孔树脂对霍山石斛的吸附和解吸特性不尽相同,结果表明AB-8树脂更适用于作石斛多酚的吸附剂,静态吸附150 min即达到饱和,总酚纯度为76.2%。吸附树脂类型是影响游离多酚的吸附和解吸附效果的一个重要因素。有研究报道,通过对9种大孔吸附树脂进行筛选,使用HPD-300型大孔吸附树脂对脱脂米糠总酚吸附效果明显优于其他,静态吸附在6 h时达到饱和吸附量9.04 mg GAE/g,解吸率为82.62%。此外,影响吸附树脂法分离纯化效果的因素不仅有树脂类型,还包括液料比、吸附和解吸流速、柱温、溶剂浓度等。

3.4 膜分离技术

膜分离技术是利用选择性透过膜,以膜两侧的能量差(如浓度差、压力差、电位差等)为动力,使粗提液组分选择性透过膜,从而达到分离效果的一种方法(图4C)。根据膜的孔径大小,可分为微滤膜(孔径:0.05～10μm)、超滤膜(孔径:0.001～0.02μm)、纳滤膜(纳米级孔径)和反渗透膜等。膜分离技术被认为具有易于规模化、降低能耗、处理后溶液热损最小及获得的产品质量高等优点,不同膜操作单元的相互结合能够有效的从食品来源中回收、纯化和浓缩多酚。尤其是针对糖类化合物,膜分离技术表现出更优益的截留系数差(NFPES10商业滤膜对佛手柑汁提取物中糖类的平均截留率最低,约35%;对酚类的平均截留率最高,介于88.4%～90.1%之间)。

膜分离示意图

也有报道显示,膜分离技术对于分子结构更为接近的多酚类物质与花青素类成分同样具有良好的分离效果,使用截留分子量为2 k Da的超滤膜纯化石榴汁,滞留物中多酚和花青素含量分别为84.8%和90.7%,用30 k Da膜以渗滤(diafiltration,DF)模式对桉树皮提取物预浓缩液进行超滤,总酚含量和原花色素含量分别增加了21%和64%。在实际应用中常选择不同孔径的膜材料和多重膜组合,并结合其他分离纯化技术以提高产品纯度、收率和品质。膜分离过程不需要采用有机溶剂和加热处理,分离得到的游离多酚活性较高,具有绿色友好、高活性保存率的特点,但滤膜的成本高一直也是限制该技术推广应用的关键因素之一,随着新材料技术的发展,膜分离技术将在食品领域得到更为广泛的应用。

3.5 高速逆流色谱法

色谱分离法主要包括纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、高速逆流色谱法等。目前,HSCCC作为一种新型分离技术逐渐受到关注。HSCCC是一种液-液色谱分离技术,其固定相和流动相均是液体,具有产品无污染、无损失、高效等优点。有学者采用HSCCC-半制备型高效液相色谱(semipreparative HPLC)联用技术,对红酒多酚进行了大规模分离纯化,共分离出17种化合物,HSCCC对于百香果种子中二苯乙烯类蛇皮素和白皮杉醇的纯化同样达到理想的纯度,这表明HSCCC技术无论对于一类化合物的分离还是特定物质的纯化都能表现出优益的效果。目前,研究溶剂的种类选择与合理组合是HSCCC技术的关键问题,其中,使用中极性溶剂体系及深共晶溶剂(deep eutectic solvent,DESs)体系被认为是理想的天然游离多酚的分离纯化方法,这个观点也陆续被学者所认同,将会是高价值植物基多酚在分离纯化领域未来发展的重要技术之一。

植物游离多酚的分离纯化方法示意图

4 结束语

由于植物基原料的多样性及基质的复杂性,在传统溶剂萃取工艺中,样品的制备是游离多酚提取的关键之一,现代辅助技术(超声波、微波和超临界流体)联用能够有效减少样品处理步骤和人为干预,从而达到提高产物的产率、选择性和再现性目的。植物基原料中游离多酚具有种属差异性与结构多样性特点,这也就意味着某一种提取或分离纯化方法无法广泛应用到各类原料。针对不同目标产物的结构特点、分子特性与环境干扰因素,采用对应的提取或分离纯化技术,从而达到精准提取一直是游离多酚研究与应用的一个重要策略。此外,在追求产率、纯度及活性的同时,有机溶剂、重金属离子及低毒小分子残留等安全问题在植物多酚应用于食品、药品、化妆品等行业领域过程中也需要受到极大的重视,因此,持续开发新型提取与分离纯化技术,选择更为绿色友好,无毒高效的理想材料或溶剂仍然是未来植物基原料中游离多酚能够进一步得到个性化开发和高值化应用的研究目标。

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